Janka Va?ková1，Beáta Velik1，Martina Pilátová2，Ivan Kron1，Ladislav Va?ko1 著
何 静3 丁亚芳3 杨 静3 李宝才3译
（1 科西策利克大学医学院医药化学生物化学与临床生物化学系 科西策 104011
2 科西策利克大学医学院药学系 科西策 104011
3 昆明理工大学生命科学与技术学院 昆明 650500）
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摘 要：腐植酸被认为在动物喂饲试验中对健康和产率具有整体积极作用，同时颇有争议的是，其也被作为肿瘤的病原学因素之一。我们尝试评价斯洛伐克地区特定来源腐植酸在使用推荐预防剂量时的体外作用。研究其体外的抗氧化性质、对肝线粒体中酶系和非酶系抗氧化防御系统的作用以及对人工培养肿瘤细胞株的作用。我们观察到不论腐植酸是溶解于二甲基亚砜(DMSO)或是直接加入呼吸介质中线粒体悬浮液，在腐植酸给药后超氧化物歧化酶(SOD)活性显著下降。所测定的其他抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物(GPx)和谷胱甘肽还原酶(GR)，其活性及还原型谷胱甘肽(G S H)的含量与对照组相比并未表现出显著变化。腐植酸对超氧阴离子自由基(O2-·)的抑制率低于其对羟自由基(·O H)的抑制率。6种不同肿瘤细胞株的存活率显示出只有急性T淋巴性白血病细胞株对测试腐
植酸敏感。尽管在水溶液中溶解度相对较低，但特定来源腐植酸参与了氧化还原调控。通过夺取自由基，腐植酸重置了抗氧化防御机制。来源于自然资源的腐植酸体外研究结果显示出其作为有前景的免疫增强剂的潜力。
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关键词：腐植酸 线粒体 抗氧化酶 谷胱甘肽 细胞培养
中图分类号：TQ314.1 文献标识码：A 文章编号：1671-9212(2013)02-0032-06
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Effects of humic acids in vitro
Janka Va?ková1, Beáta Velik1, Martina Pilátová2, Ivan Kron1, Ladislav Va?ko1 write
He Jing3, Ding Yafang3, Yang Jing3, Li Baocai3 translate
(1 Department of Medical Chemistry, Biochemistry and Clinical Biochemistry, Faculty of Medicine, Pavol Jozef
?afárik University in Ko?ice, Ko?ice, 104011
2 Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Pavol Jozef ?afárik University in Ko?ice, Ko?ice, 104011
3 Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming, 650500)
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Abstract: Humic acids are known for their overall positive health and productivity effects in animal feeding trials and,controversially, as an aetiological factor of cancer. We tried to assess the in vitro effect of humic acids from a selected source in Slovakia when used at recommended prophylactic dosage. We investigated antioxidant properties, enzymatic
and non-enzymatic antioxidant defence system in liver mitochondria and cultured cancer cell lines in vitro. We observed a significant decrease in superoxide dismutase activity after humic acids treatment irrespective of dissolving in dimethyl sulphoxide or direct addition to mitochondria suspension in a respiration medium. Activities of other antioxidant enzymes
measured, such as glutathione peroxidase and glutathione reductase, showed no significant differences from the control as well as the reduced glutathione content. Percentage of inhibition by humic acids of superoxide radical indicated lower efficacy compared with that of hydroxyl radical. Survival of six different cancer cells lines indicated that only the acute T lymphoblastic leukaemia cell line was sensitive to the tested humic acids. Despite relatively low solubilityin aqueous solutions, humic acids from the selected source participated in redox regulation. By recapturing the radicals,humic acids reloaded the antioxidant defensive mechanism. Results from in vitro study conducted with humic acids from the natural
source showed potential of these substances as promising immunity enhancing agents.
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Key words: humic acid; mitochondria; antioxidant enzyme; glutathione; cell culture.
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腐植酸是具有多元羧酸侧链，多芳环和杂环的结构复杂高分子芳香聚合物，为土壤和褐煤中天然降解的有机成分，来自被土壤菌降解的腐植物质。此外，腐植酸为于中性或碱性p H可溶，且具有化学活性的有机分子。腐植酸盐是腐植酸的阴/阳离子交换位点为Ca2+，Na+，Al3+和Fe2+而非氢的腐植酸盐类。长久以来，腐植酸被用于种植业领域中的生长刺激剂。在欧洲是用于预防及兽医治疗药物的活性物质。作为止泻剂、镇痛剂、免疫刺激剂和抗菌剂给药，并被用作替代治疗物质以提高饲料转化率和治疗营养不良及腹泻。尽管较多试验研究已显示腐植酸很大程度上是无毒和非致畸性的，但其也被认为是东亚特定病区儿童及青少年关节和生长板病变的大骨节病病因。从动物喂饲试验可知，腐植酸盐对动物健康及产率具有积极作用。腐植酸的体内或体外作用机制均尚不清楚。据观察，腐植酸作用于内皮细胞可直接增加其C a2+渗透性，增加N O/过氧硝酸盐的生成，并可能导致凋亡细胞死亡。通过氧化生成和减少人红细胞中抗氧化酶活性，腐植酸诱导棘红细胞转化和人外周血液淋巴细胞D N A氧化损伤。腐植酸还可以刺激大鼠肝线粒体呼吸作用。腐植酸分子结构与辅酶Q具有一些相似性，这意味着腐植酸可能干扰线粒体氧化还原系统。线粒体被公认为是超氧阴离子和过氧化氢的一个有效来源，甚至是在正常状态下。我们的目标是评价抗氧化性质和腐植酸对主要代谢器官线粒体酶系和非酶系抗氧化活性的作用，从而评估腐植酸的潜在毒性影响，以及在推荐预防剂量时对体外培养肿瘤细胞株的作用。
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1 材料与方法
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如未指定，使用的所有化学药品均为分析级。溶液采用双蒸水现配。腐植酸购自Humac Natur(Humac Ltd.，科西策，斯洛伐克)。腐植酸初含量为10mg/10mL[10%DMSO或磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.4]。然而，腐植酸的溶解度低；因此，将腐植酸溶液超声两次10min。过滤后，滤纸干燥至恒重，称重并提取，所测溶液中腐植酸余量为DMSO中6.4 mg/10mL(3次)，PBS中3.2 mg/10 mL。
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选用雄性Wistar大鼠(Velaz，布拉格，捷克共和国)，体重200～250 g。根据科西策大学动物护理和使用委员会批准的规程，动物处死方法为颈椎脱位和断头处死。
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肝线粒体采用Johnson和Lardy(1967)的分离方法从雄性Wistar大鼠中分离获得。线粒体蛋白含量测定使用Bradford(1976)蛋白质测定法。
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谷胱甘肽还原酶(GR；E.C.1.6.4.2)活性根据Carlberg和Mannervik(1985)的方法测定，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx；E.C.1.11.1.9)活性采用Flohe和Gunzler(1984)的方法，超氧化物歧化酶(SOD；E.C.1.15.1.1)活性按试剂盒说明书(Fluka，日本东京)进行。腐植酸给药的线粒体中还原型谷胱甘肽(GSH)含量使用Ellmans试剂(R2=0.991)通过Floreani等的改良方法测定。
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腐植酸的抗氧化性质采用Beauchamp和Fridovich(1971)的方法评价。
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有关更多内容敬请参阅《腐植酸》杂志2013年第2期“译文”之相关文章。
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（责任编辑：张勇）
